蓖麻GST的基因克隆及生物信息学分析

谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)是谷胱甘肽结合反应的关键酶,催化谷胱甘肽结合反应的起始步骤,主要存在于胞液中,有多种形式,其在病理学上有一定的重要性。本研究通过克隆GST基因以及对其进行相关的生物信息学分析。利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术扩增该基因,经分析该基因可编码219个氨基酸,并且通过相关分析得到这219个氨基酸组成的蛋白为稳定的亲水性蛋白,有一个明显的区段存在信号肽,在该蛋白中α-螺旋和无规则卷曲是主要的二级结构方式,根据序列同源比对,蓖麻、麻疯树和榴莲聚类到一起,说明相对于其他物种,它们的同源性较高。这些分析结果为蓖麻谷胱甘肽S-转移酶生物合成及其功能的进一步研究提供一定的理论与实践依据。     

NaCl胁迫对甜瓜生理指标及相关基因表达的影响

以薄皮甜瓜(IVF05、IVF89)和厚皮甜瓜(IVF117、IVF303)为试材,研究Na Cl(150 mmol·L~(-1))处理对4个甜瓜品种发芽、幼苗生长及相关基因表达的影响。结果表明,在Na Cl胁迫下,薄皮甜瓜IVF89的生长指标受到的抑制作用最大,其发芽率、发芽指数、胚根长度和胚轴长度分别下降23百分点、76.24%、46.71%和39.27%;厚皮甜瓜IVF303的生长指标受到的抑制作用最小,其发芽率下降不明显,发芽指数、胚根长度和胚轴长度分别下降46.52%、34.86%和23.08%;Na Cl胁迫提高了甜瓜幼苗叶片中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)的活性,增加了游离脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、可溶性蛋白的含量;4个甜瓜品种幼苗的净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)和SPAD值均显著降低,IVF05、IVF89、IVF117和IVF303的Pn分别下降了64.44%、69.62%、61.23%、60.00%;4个甜瓜品种的卡尔文循环(Calvin)关键酶基因1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶基因(CmRubisco)、3-磷酸甘油酸激酶基因(CmPGK)和叶绿体型果糖-1,6-二磷酸酶基因(Cm FBPase)表达均显著下调,核酮糖-5-磷酸激酶基因(Cm PRK)表达大多上调;甜瓜耐盐相关基因质膜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因(Cm SOS1)、液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因(CmNHX1)、高亲和力K~+转运体基因(CmHKT1)和N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶基因(CmGnT)的表达均上调,其中IVF303的基因表达上调幅度最大。通过主成分分析、相关分析和聚类分析等综合分析方法,将4个甜瓜品种分为3类,IVF05和IVF89为盐敏感类型,IVF117为中耐盐类型,IVF303为强耐盐类型。     

大豆RING/U-box蛋白Glyma.13G115900的克隆及其对非生物胁迫的应答

课题组前期对干旱胁迫下大豆转录组的数据分析发现大豆Glyma.13G115900基因编码一个RING/U-box蛋白,其表达水平受干旱胁迫影响显著。本研究以垦丰16大豆为试验材料,克隆Glyma.13G115900基因。氨基酸多重序列比对表明其编码的蛋白与其它物种都具有高度保守的RING/U-box结构域。构建原核表达载体pET-29b-Glyma.13G115900转化到大肠杆菌中,Glyma.13G115900蛋白在大肠杆菌中能够表达。荧光定量PCR分析表明Glyma.13G115900基因的表达量受PEG、NaCl和ABA的影响显著,但基本不受冷胁迫的诱导。经PEG和NaCl处理后,该基因表达量与CK相比呈现出显著下降的趋势,PEG处理的表达量变化比NaCl下调的更明显;在ABA诱导下与CK相比该基因的mRNA丰度呈现出先上升后下降的趋势,在4 h表达量出现峰值,推测该基因可能通过依赖于ABA途径参与非生物胁迫应答。以上结果为进一步深入研究该基因的调控途径奠定基础。     

Responses of glutamine synthetase activity and gene expression to nitrogen levels in winter wheat cultivars with different grain protein content

Glutamine synthetase (GS) plays a central role in plant nitrogen (N) metabolism, which improves crops grain protein content. A pot experiment in field condition was carried out to evaluate GS expression and activity, and grain protein content in high (Wanmai16) and low grain protein (Loumai24) wheat cultivars under two N levels (0.05 and 0.15 g N kg⁻¹ soil). High nitrogen (HN) resulted in significant increases in GS1 and GS2 expression at 10 days after anthesis (DAA), and higher GS activity during the entire grain filling stage. HN also significantly increased yield, grain protein content and protein fraction (except for glutenin of Luomai24) in two wheat cultivars, which indicated that it increased grain yield and protein content by improving nitrogen metabolism. Wanmai16 showed higher grain protein content, gliadin and glutenin content, and had higher expression level of GS2 both in flag leaves and grains at early grain filling stage. However, Luomai24 had greater yield and higher expression level of GS1. The difference expression of GS2 and GS1 genes indicates they had various contributions to the accumulation of protein and starch in wheat grains, respectively. The results suggest that GS2 would be serving as a potential breeding target for improving wheat quality.     

大豆对大豆花叶病毒SC18株系的抗性遗传和基因定位

大豆花叶病毒(soybean mosaic virus,SMV)病是我国大豆生产上的一种主要病毒病害,SMV株系SC18是我国东北和南方两大产区的优势株系,在黄淮大豆产区亦零星发生。本研究对5个抗×感杂交组合衍生后代分离群体接种SC18后,发现各组合F_1均抗病,F_2表现3∶1(抗∶感)分离比,F_(2∶3)表现1∶2∶1(抗∶分离∶感)的分离比,表明5个抗病亲本(中作00-683、滨豆95-20、东大2号、中品661和RN-9)对SC18的抗性由一对显性基因控制。抗×抗杂交组合"中作00-683×东大2号"衍生后代分离群体接种SC18,F_2出现15∶1(抗∶感)的分离比,表明中作00-683与东大2号可能各携带一对显性基因,控制对SC18的抗性,且独立遗传;抗×抗杂交组合"中作00-683×滨豆95-20"的F_1、F_2和F_(2∶3)在接种SC18后均未检测出感病株,表明中作00-683与滨豆95-20所携带的对SC18的抗性基因是等位的。利用RN-9×7605重组自交家系将RN-9对SC18的抗病基因Rsc18定位到大豆6号染色体(C2连锁群)SSR标记Satt286和Satt277之间,遗传距离为6.12和4.69 cM。     

大豆Abhydrolase_3基因家族进化分析

异黄酮是大豆的重要次生代谢物,参与植物与微生物互作。2-羟基异黄酮脱水酶(hydroxyisoflavanone dehydratase,HID)催化2-羟基异黄酮形成稳定的异黄酮。HID属于Abhydrolase_3基因家族,该基因家族具有多种功能,但该基因家族在大豆中的进化模式尚待研究。为了研究Abhydrolase_3基因家族在大豆中的进化模式,本文在大豆基因组中鉴定了62个Abhydrolase_3基因,串联和片段复制是该基因家族主要扩增方式。根据系统进化关系,将大豆Abhydrolase_3基因家族划分为8个亚家族,其中HID所在的亚家族I基因数量最多,并发生多次基因扩增事件。对大豆Abhydrolase_3基因家族结构分析表明,不同亚家族具有不同的基序。多态性分析表明,亚家族Ⅰ、Ⅲ和Ⅴ具有较高的核苷酸差异,并受到放松的自然选择。基因表达分析表明,除了亚家族II和IV外,其它亚家族的基因在大豆不同组织中有较高表达;亚家族Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ基因受病原菌诱导表达。结果说明HID所在的亚家族I存在基因扩增和功能分化,与病原菌互作相关的基因具有较高的遗传多样性并受病原菌诱导表达。     

狗头枣GSTU基因的克隆及其序列分析

为探索红枣GSTU类基因在红枣抗逆中的分子作用机制,本研究以狗头枣枣树叶片的DNA为模板,根据枣GSTU基因的序列(HM345954.1)设计引物,采用PCR方法获得GSTU基因序列,并利用生物信息学手段对其所对应蛋白的结构域、功能域、理化特性、跨膜区、二级结构及亚细胞定位等进行分析。结果表明:克隆到的DNA序列全长838 bp,具有2个外显子和1个内含子,内含子在292~460 bp碱基处,该序列与GenBank中枣的GSTU核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别为99.85%和100%,表明成功的克隆了狗头枣的GSTU基因。该序列编码222个氨基酸,分子量为25.268 kD,理论等电点(pI)为6.10;亲水性的平均数为-0.242,表明该蛋白是亲水性蛋白。二级结构主要以α-螺旋为主,其次是无规则卷曲,不存在信号肽,表明该蛋白可能为非分泌性蛋白,该蛋白可能位于内质网(膜)和质膜上。本研究获得的狗头枣GSTU基因在基因结构上含有1个内含子,在核酸序列及氨基酸序列上与GenBank中枣的GSTU基因同源性高,并对其理化性质、结构等进行了预测与分析,为进一步研究红枣抗逆分子机制提供理论基础,同时为红枣品种的选育提供理论支持。     

玉米轴色突变体698-3R的遗传鉴定

以辐射诱变获得的玉米红轴突变体698-3R为材料,通过遗传交配设计分析轴色的遗传规律,利用SSR-BSA法初步定位轴色基因,并对候选基因进行克隆和表达分析。结果表明:(1)突变体698-3R的红轴对白轴性状表现为显性遗传,受一对核基因控制,初步定位在第一染色体上的SSR标记phi095与umc1452之间,与phi095相距3.9cM,与umc1452相距7.1cM,将该基因暂定名为C(t);(2)以轴色基因 P1的cDNA为模板克隆C(t),发现698-3R有3个C(t)转录本,而野生型698-3中至少有2个;预测氨基酸序列比对发现,698-3R中3个C(t)蛋白的氨基酸序列与已知P_1-wr蛋白一致,突变使其获得完整的MYB结构域和酸性激活域,而野生型698-3中698-3-P-1蛋白由于编码序列缺失导致移码突变,不具有该功能结构域;(3)对C(t)基因qRT-PCR分析发现,除25DAP外,其余4个时期在698-3R中表达水平均显著或极显著高于698-3;以 A1和 C2基因表达验证分析发现,C(t)与验证基因表达模式一致,说明C(t)可能具有 P1激活调控 A1和 C2基因表达的功能。推测该红轴基因C(t)可能为一个 P_1-wr基因。     

柞蚕饲料转化效率的遗传模型与基因效应值的估算

利用2对柞蚕杂交组合8821×四青、8822×青6号的6个世代材料,对柞蚕茧重转化率和茧层生产率两个数量性状进行了遗传分析,结果表明:茧重转化率的基因作用复杂,不符合加-显性遗传模型,存在着基因互作,且显性互作大于显性效应,使茧重转化率增加;茧层生产率的基因作用符合简单的加-显性遗传模型,显性效应为正值,使茧层生产率增加。     

类蚕丝丝素结晶区蛋白表达载体的构建与表达

为探讨蚕丝结构与性能的关系,设计了几种类似蚕丝丝素结晶区高度重复序列结构(GAGAGX)n的基因序列,并构建了大肠杆菌表达载体,在BL-21菌株中成功诱导表达了4种约由110个氨基酸组成的小分子蛋白。对表达产物进行W estern印迹分析和ELISA检测的结果显示,(GAGAGA)n、(GAGAGY)n、(GAGAGV)n3种蛋白都有小于14.4 kD的大小相同的条带,而(GAGAGS)n有一条稍大于20.1 kD的条带。以超声波破菌的缓冲液作空白对照,4种蛋白的ELISA的结果均比对照的BL-21(无质粒)高,显示为阳性。